Développement et validation des résultats du génotypage des porcs a l'aide de marqueurs ADN haploïdes

Abstract

Cet article présente les résultats du développement et de la validation d'une technique d'extraction de l'ADN. Il a été constaté que la méthodologie développée présente une activité d'hybridation prononcée en relation avec la matrice ADN à 65°C avec la concentration d'ions magnésium dans le mélange réactionnel 1,5 mM/µl. Indicateurs présentés test de sensibilité, Limites de détection et spécificité de la méthodologie, indiquant qu'il peut être utilisé pour détecter ADN transfecté. Cette méthode a été utilisée pour détecter les empreintes d'ADN transfectées sous forme de contamination des échantillons étudiés de poils provenant de l’oreille de porcs (n=12). Le typage de l’ADN pour identifier le génome mitochondrial de porcs hybrides a été effectué en examinant des échantillons de poils et de tissu épithélial d’oreilles de porc. Les empreintes de traces détectées fournissent des preuves objectives pour caractériser les traces d’ADN de cadavres d’autres échantillons biologiques, trouvé sur la « scène de crime », lors de l’échantillonnage lors de l’abattage de porcs dans une usine de transformation de la viande. Cependant, le typage de l’ADN à partir d’échantillons allant jusqu’à 10 cheveux est souvent problématique en « médecine légale ». Une laine de porc contient une très petite quantité d’ADN ou un échantillon de laine se compose de laine avec des racines de mauvaise qualité ou même des tiges de cheveux cassées sans racines. Les échantillons prélevés avant l’étude ont été traités avec de l’eau distillée. En raison du fait que les oreilles des porcs étaient avec des impuretés de sang, de la saleté de poussière. L’extraction de l’ADN des poils a été réalisée à l’aide de la résine échangeuse d’ions Chelex-100, selon des recommandations méthodiques (Korinnyi S.M., Pochernyaev K.F., Balatsky, V.M., 2005). Il n’a pas été possible de valider les résultats du génotypage à l’aide de la méthode d’extraction de l’ADN à partir d’échantillons de poils, en raison du fait que des traces d’ADN étranger, des cadavres d’ADN de porcs ont été trouvés dans les échantillons étudiés lors de l’abattage à l’usine de transformation de la viande. Ceci est mis en évidence par la méthode très sensible de l’analyse PCR et hydrolyse par l’endonucléase TasI du site variable étudié de la boucle D d’ADNmt de porcs. Comme en témoigne la détection des résultats de l’électrophorégramme, sur lesquels des fragments contaminés non spécifiques sont clairement visibles – ADN transfecté. Nous décrivons ici une étude pilote d’une méthode d’extraction de l’ADN du tissu épithélial des oreilles de porc et quantification à l’aide de l’analyse PCR. Avant d'extraire l'ADN du tissu épithélial des oreilles de porc les échantillons testés ont été traités - feu flamboyant. L'extraction d'ADN à partir du tissu épithélial de l'oreille du porc a été réalisée par la méthode du sorbant en utilisant Kit de réactifs pour l'isolation de l'ADN "DNA-sorb-B" de «TOV InterLabService - Ukraine». Traitement préliminaire des échantillons d'essai avec le feu de l'alcool sec s’est avérée être une méthode efficace basée sur les résultats de l’analyse PCR boucle D de la région variable du génome mitochondrial de porcs hybrides. L’ADNmt haploïde transporté par les mitochondries du cytoplasme cellulaire a un mode de transmission maternel(les animaux héritent de l’ADNmt de leur mère et non de leur père). Ces caractéristiques permettent de reconstruire les relations intra-évolutives en évaluant des modèles de mutations de l’ADNmt. Les polymorphismes dans la région hypervariable de la boucle D ont grandement contribué à l’identification des descendants sauvages d’espèces porcines domestiques et à la création de modèles géographiques de diversité génétique. Les marqueurs X-mitochondriaux sont utilisés pour l’identification en cas d’absence de maternité, analyse de traces mixtes d’ADN mâle et femelle de cadavres de porcs. Les marqueurs X-SNP sélectionnés conviennent à la détermination des haplogroupes européens les plus importants. Mise au point d'une méthode pour désactiver l'ADN transfecté a permis de déterminer les véritables haplotypes des échantillons étudiés. Les haplotypes suivants ont été identifiés: 3 porcs atteints de l’haplotype C - sous-espèces de porc sauvage, Landrace, Hampshire, Pays de Galles (en anglais: Wales) (Ukraine, Pologne); 1 cochon est un représentant sous-espèces de porc sauvage, Wales (Italie), haplotype G; 4 porcs sont des représentants de l’haplotype O - sous-espèces de porc sauvage, Landrace (Suède); 2 porcs sont porteurs de l’haplotype N - Grand Blanc (en anglais: Large White) (type asiatique); parmi l’échantillon de porcs étudié, il n’y a que 1 haplotype K - introuvable parmi les races porcines domestiques. Intérêt pour le typage du polymorphisme mononucléotidique (SNP) en criminalistique, l’expertise en génétique moléculaire ne se développe pas seulement en raison de l’utilité du SNP pour déterminer les chromosomes Y et X, haplogroupes et haplotypes ADNmt, ainsi que pour l’analyse de l’origine géographique des échantillons étudiés. Notre intérêt pour le polymorphisme SNP était motivé par les avantages potentiels des tests en raison du faible taux de mutation, en particulier dans l’analyse d’échantillons dégradés à l’aide d’amplicons de la région variable D de la boucle – 428 paires de bases. Méthodologie testée expérimentalement pour l'extraction d'ADN à partir d'échantillons prélevés lors de l'abattage des porcs dans l'usine de transformation de la viande «Globino» - recommandé pour une utilisation dans la pratique. Le travail a été fait avec le soutien de l’Académie nationale des sciences agraires de l’Ukraine 31.01.00.07.F. « Étudier l’effet pléiotropique des gènes le SNP utilisés dans Sélection Assistée par Marqueurs de porcin » DR № 0121U109838.