Implementarea metodei PCR pentru identificarea tulpinilor patogene Allorhizobium vitis ce provoacă cancerul bacterian al viței-de-vie

Abstract

In the process of obtaining grapevine clones free from viral diseases and bacterial cancer, there are often cases where protoclones, seemingly healthy, well-developed, and with high yields, are found to be latently infected with bacterial cancer. This disease is most caused by agrobacteria from the genus Allorhizobium vitis and sometimes by Agrobacterium tumefaciens, and it is one of the most destructive diseases for grapevines from an economic perspective. The bacterial pathogen exists systemically in grapevines and spreads through infected propagation material. In the present study the Triplex End-Point PCR method was used for accurate and rapid identification of pathogenic strains of agrobacteria. One-year-old mature vines from 6 varieties and forms of grapevines were taken for the research. Microbiological testing on Roy & Sasser semiselective medium showed that five of the six plants tested were positive for Agrobacterium spp. infection. The positive tested samples were subjected to PCR testing. The presence of PehA gene, which is used to identify Allorhizobium vitis and to differentiate it from Agrobacterium tumefaciens, was confirmed in all tested samples. The virF and virD regions associated with the production of nopalins, octopins and vitopns were also detected. The test results suggested that the method allows for the reliable detection of pathogenic cultures carrying the tumor-inducing plasmid. The obtained results contribute to the development of strategies to combat bacterial cancer infections and improve phytosanitary selection practices for grapevine propagation material.

În procesul de obținere a clonelor de viță de vie libere de boli virale și de cancer bacterian, adesea se observă cazuri în care plantele, aparent sănătoase, bine dezvoltate și cu o producție ridicată, se dovedesc a fi infectate latent cu cancer bacterian. Această boală este cauzată cel mai des de agrobacterii din genul Allorhizobium vitis și uneori de Agrobacterium tumefaciens și este una dintre cele mai distructive boli, din perspectivă economică, pentru vița de vie. Patogenul bacterian există sistemic în vița de vie și se răspândește prin materialul de propagare infectat. În prezentul studiu a fost utilizată metoda PCR Triplex End-Point pentru identificarea precisă și rapidă a tulpinilor patogene de agrobacterii. Pentru realizarea cercetărilor au fost prelevate vițe mature de un an de la 6 soiuri și forme de viță de vie. Testarea microbiologică pe mediul semiselectiv Roy & Sasser a demonstrat că cinci dintre cele 6 plante testate au prezentat rezultate pozitive pentru infecția cu Agrobacterium spp. Loturile testate pozitiv au fost transferate la etapa investigației prin metoda PCR. În toate probele testate a fost confirmață prezența genei PehA (466 bp), care servește pentru identificarea bacteriei Allorhizobium vitis și pentru diferențierea ei de Agrobacterium tumefaciens. De asemenea s-au detectat regiunile virF (382 bp) și virD (320 bp) asociate cu producția de nopaline, octopine și vitopine, ce servesc drept sursă de nutrienți pentru bacterii. Rezultatele testărilor au sugerat că metoda permite detectarea fiabilă a culturilor patogene purtătoare de plasmida inductoare de tumori. Rezultatele obținute contribuie la dezvoltarea strategiilor de combatere a infecțiilor cu cancer bacterian și la îmbunătățirea practicilor de selecție fitosanitară a materialului de multiplicare viticol.